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哈工大抗氧化研究院

抗氧化研究

 藍莓花青素的抗氧化作用和抑菌性研究:

 以測定藍莓花青素對超氧陰離子自由基、羥基自由基 (·OH) 、DPPH自由基 (DPPH·) 的清除能力來評價藍莓花青素的抗氧化能力, 通過對E.coli的抑制作用評價其抑菌性。結果顯示, 藍莓花青素對超氧陰離子自由基、羥基自由基及DPPH自由基清除率隨著藍莓花青素濃度的增大而提高, 并且其抗氧化能力高于等濃度的抗壞血酸;藍莓花青素可有效抑制E.coli的生長。所以, 藍莓花青素具有很高的抗氧化活性和一定的抑菌作用。


 花青素又稱花色素, 是一類水溶性天然色素, 屬黃酮類化合物, 多以糖苷形式存在, 結構單元為α-苯基苯并吡喃型陽離子。藍莓又名越橘, 為杜鵑花科越橘屬多年生落葉或常綠灌木, 品種豐富, 富含花青素。本試驗采用花青素含量高的野生種藍莓鮮果。目前, 國內外對藍莓花青素已有多項研究, 常規提取工藝已經建立。本研究在藍莓花青素高效提取的基礎上, 深入探明其抗氧化能力和抗菌能力, 以加速藍莓花青素的市場開發。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

 野生種藍莓果采自芬蘭 -拉普蘭德地區。紫外-可見分光光度計、電熱恒溫水浴鍋、電熱鼓風、干燥箱超凈工作臺。

1.2 藍莓花青素制劑

 藍莓花青素制劑由本實驗室制備。主要工藝流程如下:取藍莓鮮果破碎后用乙醇浸提, 過濾后離心得花青素提取液, 經聚酰胺樹脂吸附, 用60%乙醇洗脫后旋蒸得到花青素純化液, 再低溫真空干燥得藍莓花青素凍干粉。最后用超純水配制成100mg/ml的藍莓花青素制劑。

1.3 實驗方法

1.3.1 藍莓花青素抗氧化活性的測定

1.3.1. 1 超氧陰離子自由基清除能力的測定

 25℃水浴中放置4.5ml 50m M p H 8.2的Tris-HCl緩沖液20min, 加入1ml 100mg/ml的藍莓花青素制劑樣品和0.5ml 25m M鄰苯三酚溶液, 混勻并在25℃水浴中靜置5min后加入1ml8M HCl終止反應。以Tris-HCl Buffer作為參比, 空白對照組為雙蒸水, 對照組為等濃度的抗壞血酸溶液。每個試驗重復三次, 425nm處測定其吸光度A, 取平均值用以計算清除率。

1.3.1. 2 羥基自由基 (·OH) 清除能力的測定

 取1ml 9m M Fe SO4、1ml 9m M水楊酸的乙醇溶液、1ml藍莓花青素樣品, 加入1ml 8.8m M H2O2, 37℃水浴靜置30min。以蒸餾水為參比, 空白對照組為雙蒸水, 對照組為等濃度的抗壞血酸溶液。每個試驗重復三次, 510nm處測定其吸光度A, 取平均值用以計算清除率。

1.3.1. 3 DPPH自由基 (DPPH·) 清除能力的測定

 用無水乙醇配制0.04mg/ml DPPH·溶液, 避光保存。2ml DPPH·溶液與2ml藍莓花青素樣品充分混合, 靜置30min??瞻讓φ战M為雙蒸水, 對照組為等濃度的抗壞血酸溶液。每個試驗重復三次, 515nm處測定其吸光度A, 取平均值用以計算清除率。

1.3.2 藍莓花青素抑菌活性的測定

1.3.2. 1 E.coli生長曲線的繪制

 配置1.25mg/ml藍莓花青素菌液, 且含菌數為103-105個/ml, 37°C震蕩培養, 每小時取樣測A532, 繪制E.coli生長曲線。

1.3.2. 2 藍莓花青素對E.coli敏感性的測試

 分別于1.5ml EP管中加入0、12.5、25、50μl藍莓花青素樣品, 加入5μl E.coli, LB培養基補至lml。37°C震蕩培養1.5h, 取100μl菌液接種至LB固體培養基。37°C恒溫培養12h。采用液體倍比稀釋法測定MIC (最低抑菌濃度) 和MBC (最低殺菌濃度) 。每個處理重復3次。

2 結果與討論

2.1 藍莓花青素的抗氧化活性

 藍莓花青素抗氧化活性的測定方法有多種,本次實驗研究通過測定超氧陰離子自由基的清除能力、羥基自由基的清除能力、DPPH自由基的清除能力來確定藍莓花青素的抗氧化能力。

2.1.1 對超氧陰離子自由基的清除作用

 

藍莓花青素、抗壞血酸清除超氧陰離子自由基的能力比較 

 藍莓花青素清除超氧陰離子自由基的能力顯著, 且隨著制劑濃度的增加, 其清除作用不斷增強。當濃度達0.3mg/ml時, 其清除率達80%。

2.1.2 對羥基自由基的清除作用

藍莓花青素和抗壞血酸對·OH的清除能力比較

 藍莓花青素清除羥基自由基的清除率, 藍莓花青素清除·OH的能力高于抗壞血酸。

2.1.3 DPPH自由基的清除作用

藍莓花青素和抗壞血酸對DPPH·的清除能力比較

 藍莓花青素對DPPH自由基清除作用顯著, 且其清除率在制劑濃度高于0.005mg/ml時高于抗壞血酸。而在藥物濃度低于0.005mg/ml時低于抗壞血酸。

2.2 藍莓花青素對E.coli生長曲線的影響

藍莓花青素對E.coli生長曲線的影響

 在3-8h為E.coli的正常對數生長期, 在含有1.25mg/ml藍莓花青素的LB中, E.coli生長曲線變化明顯:在藍莓花青素制劑作用4h后, 菌體數目下降, 6h后很快進入衰亡期, 沒有達到正常的生長高峰。這表明, 藍莓花青素主要抑制了E.coli對數生長期的菌體分裂。

2.3 藍莓花青素對E.coli生長的抑制作用

藍莓花青素對E.coli生長的抑制作用

 藍莓花青素對E.coli的生長有明顯的抑制作用, 且隨著藍莓花青素濃度增加, 抑菌效果顯著增加。當藍莓花青素樣品濃度達5mg/ml時, 未檢測到E.coli菌落的出現, 對E.coli生長的抑制率為100%。液體倍比稀釋法測得藍莓花青素對E.coli的MIC及MBC為0.734 (mg/ml) 和1.36 (mg/ml) 。

3 結論

 藍莓花青素清除超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基的能力顯著高于等濃度的抗壞血酸, 其清除率隨其濃度增加而提高, 且對E.coli生長具有較好的抑制作用, 可以作為天然抗氧化劑在食品工業中進行開發應用。



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